价格:853
货号Calcein-AM/PI Double Stain Kit Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒
产品详情
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产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
储存 |
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Calcein-AM/PI Double Stain Kit Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒 |
HRX1374 |
500T |
-20℃避光 |
| HRX1375 |
1000T |
-20℃避光 |
产品描述
Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM 和CFDA)相比，由于Calcein,AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。
由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM 常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA 双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm,Em=617 nm），因此PI 仅对死细胞染色。由于Calcein 和PI-DNA 都可被490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm 激发，仅可观察到死细胞。
本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM 和PI 的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就100µL细胞悬液进行染色，可以做500 次检测。
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
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HRX1374 (500T) |
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A |
Calcein-AM Solution (2 mM) |
50μL |
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B |
PI Solution（1.5 mM） |
150μL |
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C |
10×Assay Buffer |
50mL |
运输和保存方法
冰袋运输；其中A组分和B组分需-20℃避光干燥保存，C组分-20℃保存，经常使用可放在4℃保存。一年有效。
使用方法
- 工作液的前处理
(1)从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水10 倍稀释以得到1×Assay Buffer。
(2)由于Calcein-AM 的稳定性受温度影响较大，建议收到货后，可分装为小份，密封避光保存于-20℃，不能反复冻融。若染色液经稀释，建议当天用完。
- 细胞处理
(1)悬浮生长的细胞，收集至离心管，450g，离心5min，去除上清。用1x 的Assay Buffer洗涤细胞，450g，离心5min，2 次，去除残留酯酶。
(2)贴壁细胞经0 .25%胰酶-EDTA 消化后，收集细胞，用1x 的Assay Buffer 洗涤细胞，450g，离心5min，2 次，去除胰酶及残留的酯酶。
- 染色步骤
(1)离心得到的细胞沉淀用1×Assay Buffer 重悬，使重悬后细胞悬液计数细胞量为1 ×105~6 个/ml
(2)每1ml 的细胞量加入1-2μl 的Calcein-AM（原液），吹打混匀，37℃避光孵育20min-25min。
(3)将试剂盒自带的PI 原液取3 -5μl 加入上述染色细胞中，室温避光染色5min。
(4)孵育荧光后的细胞，450g，5min，离心去除染色液。
注：细胞进行荧光染色时建议全程避光。
(5)用1x 的PBS 清洗细胞450g，5min，离心后用1x PBS 重悬细胞，取3 -5μl 滴在洁净的载玻片上，用干净的盖玻片压片后，请及时荧光镜检。
(6)荧光显微镜下使用490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意事项
1）贴壁细胞也可以不消化，直接去除培养基，经1×Assay Buffer 浸洗2min，2 次。按上述细胞量和染色液浓度比例进行染色，染色时间和染色液工作浓度可按实际检测调整。
2）Calcein-AM 作用于细胞，一般细胞量在1×105-6 个时，Calcein-AM 的工作浓度基本在2-4µM（如遇镜检荧光亮度过强，稀释比例可适当调整在1:500 到1:2000 或更大）；PI 的工作浓度在5µM 左右。但由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM 和PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
3）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。
注：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料针对不同细胞的最佳工作浓度。
a)用0.1%皂素或者0 .1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
b)用0.1-10µM 的PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度
c)用0.1-10µM 的Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。
4）为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！