价格:1,500
货号λ噬菌体基因组DNA提取试剂盒
产品详情
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产品信息:
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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λ噬菌体基因组DNA提取试剂盒 |
HRQ0560 |
50T |
产品简介：
λ噬菌体载体广泛用于文库筛选，目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌体，噬菌体被SDS裂解，残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。
储存事项：
1）本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
2）试剂盒储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品特点：
1.不使用有毒的苯酚等试剂。
2.简捷，单个样品操作一般可在90分钟内完成。
3.典型的产量 10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约 10µg λ噬菌体DNA。
4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280 典型的比值高达 1.7～1.9，可直接用于测序和酶切反应等。
产品组分：
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组分 |
存储 |
50T |
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平衡液 |
室温 |
5ml |
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RNase A |
-20℃ |
20mg |
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DNase I |
-20℃ |
50mg |
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噬菌体沉淀液 |
室温 |
100ml |
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裂解缓冲液 |
室温 |
30ml |
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杂质沉淀液 |
室温 |
5ml |
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结合液LB |
室温 |
20ml |
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漂洗液WB |
室温 |
13ml 第一次使用前请添加52mL无水乙醇 |
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洗脱缓冲液EB |
室温 |
10mL |
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吸附柱AC |
室温 |
50个 |
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收集管 |
室温 |
50个 |
使用前必读：
1、使用转速可以达到13, 000rpm的冷冻离心机
2、开始实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。
3、需要自备氯仿 ， 20%SDS。
4、在 RNase A 管和 DNase I 管分别加入 1 毫升的裂解缓冲液吹打 ，颠倒混匀 ，充分溶解 RNase A 和 DNase I 后 ， 按照每次使用量分装-20℃冻存 ，有效期 6 个月。
使用方法：
以10mL噬菌体感染细菌培养上清提取举例：
提示：
→第一次使用前请先在在 漂洗液WB中添加指定量的无水乙醇，并做好标记！
→将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。
1、将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物 10,000g（约 12,000rpm） 4℃离心10 分钟去除细胞碎片和残渣。
转速不能过高，时间不能过长，否则噬菌体可能和碎片一起沉淀，降低产量。
2、取10ml 上清，加入 20μl RNase 和 20μl DNase 充分混匀 37℃温育 30 分钟。
每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化过头，可能减少产量；消化不完全，可能未消化的DNA/RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌DNA，因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。
3、加入2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液，轻柔充分混匀后置冰上冷却（培养板裂解物必须在冰上放置 30 分钟）。
4、10,000g（12,000rpm）4℃离心 10 分钟，弃上清，干燥 1 分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。
5 、加入500μl 裂解缓冲液，吹打重悬噬菌体，加入 100μl 20％SDS，立即轻柔颠倒混匀4-6 次后，70℃温育 10 分钟，然后置冰上冷却。
6 、加入100μl 杂质沉淀液，立即轻柔颠倒混匀 4-6 次，最高速 13,000g 4℃离心 10分钟。
7、柱平衡：向吸附柱AC中加入100 µl平衡液，13, 000 rpm 离心1 min，弃滤液，备用。
平衡液可以增强硅胶膜的吸附核酸能力，请使用当天处理的吸附柱。
8 、仔细将上清转入新的离心管 ，加入 350μ l 结合液 LB ，轻柔涡旋混匀。
9、将上述混合物加入一个吸附柱 AC 中 ，（吸附柱放入收集管中） 13,000rpm 离心 30 秒 ，倒掉收集管中的废液。
吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱内，重复步骤8。
10、加入 600μ l 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!） ， 13,000rpm 离心 15 秒 ，弃废液。
11 、 可选步骤 ：重复步骤 10 一遍。
12、将吸附柱 AC 放回空收集管中 ， 13,000rpm 离心 2 分钟 ，尽量除去漂洗液 ， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应
13、取出吸附柱 AC ，放入一个干净的离心管中 ，在吸附膜的中间部位加 100μ l 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热） ， 室温放置 1 分钟 ， 13,000rpm 离心 1 分钟。如果想得到较多量的 DNA ，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中 ， 13,000rpm 离心 1 分钟。
洗脱体积越大 ，洗脱效率越高 ，如果需要 DNA 浓度较高 ，可以适当减少洗脱体积 ，但是最小体积不应少于 40μ l ，体积过小降低 DNA 洗脱效率 ，减少 DNA 产量
14、 DNA 可以存放在 2-8℃ , 如果要长时间存放 ，可以放置在-20℃
常见问题和解决方法
| 常见问题 | 建议和解决方法 | ||
| 低核酸产量或者纯度不高 |
* 试剂盒储存在非最佳条件-建议：收到试剂盒后总是存放在室温（15℃-20℃）。* 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议：储存在室温（15℃-20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH 改变和污染。 漂洗液 WB 中忘记加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液 WB中加入指定量无水乙醇。 * 试剂和样品没有充分混匀-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。 * 噬菌体上清滴度太低-建议：1.确认λ噬菌体已经完全裂解了宿主菌（加入 0.5%的氯仿可以帮助完全裂解）；2.离心去除宿主菌碎片残渣时间不能超过 10 分钟，转速不超过 10,000g，否则否则噬菌体也可能和碎片一起沉淀丢失；3.重新培养一次噬菌体感染细菌。 * DNase I/RNase 消化不足或者过头-建议：消化过头，可能减少产量并导致最后污染宿主菌 DNA；消化不完全，可能未消化的 DNA，RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体，因此可以适当调节用量。 |
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| 宿主菌基因组DNA残留过高 | DNase I/RNase 失活或者反应条件不佳-建议：DNase I/RNase 必须溶解在裂解缓冲液中，必须分装冻存。λ噬菌体必须用 LM(含镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNase 消化活性可能受到影响。 | ||
| 加入噬菌体沉淀剂后未见到λ噬菌体沉淀 |
* 不适合的离心温度和离心力。建议：10,000g（12,000rpm）4℃离心10 分钟。 * 上清中含λ噬菌体太少-建议：离心前，样品置冰上冷却。参见前面滴度太低解决办法 |
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| DNA 下游酶切不能切开或者酶切不完全 |
*忘记做步骤 12，乙醇抑制了酶切反应-建议：做步骤 12，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取上清使用。 *使用了错误的培养基培养λ噬菌体-建议：λ噬菌体必须用 LM(含镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNA 酶切活性可能受到影响。培养板培养必须用琼脂糖 Agarose 板，如果用琼脂 Agar 板，可能抑制酶切。 |
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| 纯化的 DNA产物D260数值异常偏高 | 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数-建议：将洗脱的回收 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取上清使用。 | ||
产品仅用于科研等非医疗用途！