• 说明书丨HRF0711-HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA荧光定量PCR试剂盒.pdf

产品信息 

产品描述

        HRbio™ miRNA qPCR Kit采用 SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA的荧光定量检测。本产品包含miRNA qPCR所需要的所有试剂，组分分别是：2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。其中2×miRNA qPCR Mix（含SYBR Green）是专门为miRNA荧光定量检测而特别研发的新一代预混液形式的qPCR试剂。其中DNA polymerase采用的是抗体修饰的热启动形式，配合特殊的buffer体系，使得反应特异性更好，灵敏度更高，并且在更广的范围内进行准确定量。

产品组分

运输与保存方法

1.-20°C 避光保存至少 12 个月，使用前充分融解混匀。

2.2 ×miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短期使用可放在 4°C，避免反复冻融。

3.Reverse primer(10μM )每次用完置-20°C 保存。

注意事项

1.miRNA 第一链cDNA 的加入量不要超过real time PCR 体积1/10。

2.对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）。

3.本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

4.2 x miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差

5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6.本产品仅作科研用途！

操作步骤

1. 在室温融化2 ×miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。
2. 使用时请将2 ×miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。注：请不要使用振荡器混匀。
3. 按照下表组分冰上进行反应液的配制：

【注】： 使用前务必充分混匀， 避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1- 1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5- 10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20μL或50 μL ，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

PCR 循环（三步法）

PCR 循环（二步法）

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a)  预变性时间： 根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。

b)  退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c)  荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec 以上：Applied Biosystems: 7300

34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d)  熔解曲线： 通常情况下可以使用仪器默认程序。

上游引物设计指南

1.遵循引物设计的普遍原则。

2.以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础的设计方法。

3.本试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值尽量保证在65℃左右。

4.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或者C碱基）；也可以在3’端添加1个或者几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。

5.若按照原则2设计的方式直接设计的引物，其Tm值过高，可以在引物的5’或者3’端去掉几个碱基。