质粒中量提取试剂盒(溶液型,无内毒素,转染级)

质粒中量提取试剂盒(溶液型,无内毒素,转染级)

价格:980

货号

产品详情

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产品信息 

 

产品名称

产品编号

规格

质粒中量提取试剂盒(溶液型,无内毒素,转染级)

HRN0091

20T

质粒中量提取试剂盒(溶液型,无内毒素,转染级)

HRN0092

40T

 

产品描述

      本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA,采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂,只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质,获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右,得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5ml小离心管中操作,方法简单,不需特殊设备,无需过柱,不用酚氯仿抽提;基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤小,即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒,只要碱裂解法能够提取,就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒,浓度可高达5μg/μl。超螺旋比例可高达95%,无内毒素,转染效果好。

产品组分

组分

存储

20次(HRN0091)

40次(HRN0092)

RNase A(10mg/ml)

4℃

0.75 ml

1.3 ml

溶液P1

4℃

65 ml

130 ml

溶液P2

室温

50 ml

100 ml

溶液PⅢ

室温

50 ml

100 ml

杂质清除剂A

室温

1.5 ml

3 ml

杂质清除剂B

室温

15 ml

30 ml

内毒素清除剂

-20℃

5 ml

10 ml

 

适用范围

适用于中量高纯或者转染级质粒制备和 BAC/PAC 大型质粒制备。

产品特点

1.不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、从50-70 ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中,可快速提取150μg -600μg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80-90 %。

2.获得的质粒产量高,浓度高,超螺旋比例高,纯度好,可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

内毒素含量极低(< 0.1 EU/μg DNA),可直接应用于细胞转染。

 

运输和保存方法

1.第一次使用时,将试剂盒所带全部的 RNaseA加入溶液P1后(终浓度100μg/mL)置于4℃保存。如果溶液P1中RNaseA失活 ,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留 ,在溶液P1中补加 RNaseA 即可。

2.内毒素清除剂在 4℃可保存一个月 ,如果要长期保存 ,建议保存在-20℃!

3.环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀 ,可在 37℃水浴加热几分钟 ,即可恢复澄清 ,不要剧烈摇晃 ,以免形成过量的泡沫。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、 pH值变化 ,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

5.本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

 

注意事项

1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒 ,应加大菌体使用量,同时按比例增加 P1、P2、PIII的用量。

2.提取大质粒时操作动作要轻柔 ,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA的损坏。

3.DNA沉淀液沉淀离心后 ,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心 DNA 丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定 ,以确定是否获得终产物(数百微克 DNA 离心沉淀在管的侧壁上, 可能无法看到明显团块)。

4.得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为 1 相当于大 约 50μg/mL DNA。 电泳可能为单一条带 ,也可能为⒉条或者多条 DNA 条带 ,这主要是不同程 度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成 ,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。

5.质粒DNA 确切分子大小 ,必须酶切线性化后 ,对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道。处于环状 或者超螺旋状态的质粒 ,泳动位置不确定 ,无法通过电泳知道确切大小。

6.本产品仅供科研用途!

使用方法

提示:将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,使用后置于2-8℃保存。

1.取过夜培养菌40-60ml(最大不超过90 ml)菌液,装入50ml离心管中,4,500~6,000 x g于4℃离心5 min沉淀菌体(也可12,000 x g离心2分钟),完全弃除上清。

2.加入2.5 ml 溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。室温放置3~5 min。  

如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。

3.加入2.5 ml 溶液P2,轻轻颠倒离心管6~8次,室温放置5 min,使细菌完全裂解,溶液透明。

温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

4.加2.5 ml溶液PⅢ,立即颠倒离心管6~8次,充分混匀,至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min,小心吸出上清,移入新的50 ml离心管中。

加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。

注意: 使用异丙醇沉淀,蛋白杂质和盐离子共沉淀较少,可能看不到明显的较大团块沉淀,但是质粒还是可以完全沉淀下来,不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作,可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。

5.加入5 ml 异丙醇,颠倒离心管,充分混匀。

6.于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min,小心弃去上清,倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体,加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍,最高速离心5分钟,弃上清,晾干沉淀。

DNA沉淀如果干燥过头,DNA将无法完全溶解,但是如果乙醇没有晾干挥发干净,残留太多,也会造成DNA无法完全溶解。

注意:异丙醇离心沉淀后,质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀,但是不影响产量,后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。

7.加入0.7 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块,注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽然可能看不见,也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来(大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。然后将质粒溶液转入1个新的1.5 ml离心管中。

可选步骤(一般不需要):如果菌株RNA丰富有微量RNA残留,可在此步骤后将质粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8.加入55μl杂质清除液A,颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的内毒素清除剂,颠倒旋转7-10次(30秒左右)充分混匀,冰浴或者冰上放置>=5分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。

内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。

注意:如果不需要去内毒素用于转染,可在此步骤只加入55μl杂质清除液A,充分混匀后冰上放置5分钟,离心后小心取上清转入一个新管,直接接步骤11。

9.42℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后42℃温育5分钟。

10.室温14,000 x g离心5 min分相(温度低时,内毒素清除剂无法分相,因此必须至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上)。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。

溶液必须分为上下两相,否则应重复步骤9-10。

11.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B(约750μl),轻柔混匀,4℃ 14,000 x g离心10 min,弃上清(注意不要丢失DNA),轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤,离心弃上清,共两次,室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。

12.加适量TE或者纯水(50~100μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡以辅助溶解)。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上,即使看不见,也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。

最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解,这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA(高达5-10μg/μl)。如果有需要,客户也可以选择更大体积溶解。

 

 

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