• 说明书丨HRK2901-植物根系活力检测试剂盒(TTC法)(1).pdf

产品信息:

产品简介：

    根系是植物吸收水分和矿质营养的主要器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、 转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平等，根系活力具 有重要的实际意义。

     TTC 可被氢还原成不溶性的红色三苯基甲臜（TTF），TTF 在 485nm 处有吸收峰。当 TTC 溶液渗入到植物根 部组织时，呼吸过程产生的还原物质可将其还原成 TTF(红色)，植物根部组织被染成红色。根系活力强弱可用 TTC 的还原量来表示。此方法检测的根系活力即植物根系的脱氢酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。

试剂组成与配置

试剂一 A：粉剂×2 瓶，2-8℃保存。

试剂一 B：粉剂×2 瓶，2-8℃保存。

试剂二：液体 125 mL×1 瓶，2-8℃保存

试剂三：粉剂×3 支，常温保存。

试剂四：液体 120 mL×1 瓶（自备），2-8℃保存。

标准品 A：粉剂×1 支，2-8℃保存。

标准品 B：粉剂×1 支，2-8℃保存。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取一支试剂一 B 加入一瓶试剂一 A 中，加入 30mL 试剂二溶解。现用现配。配制好后置 于 2-8℃，一周内使用，若出现红色，则不能使用。

2、 试剂二：若试剂有结晶析出，可 40℃加热或者超声溶解。 3、 试剂四：乙酸乙酯，自备。提供一 125mL 空瓶。

4、 标准品：临用前将标准品 B 倒入标准品 A 中，再加入 1mL 试剂二，充分震荡混匀（可再用溶解好的标准 品润洗标准品 B 管）, 即 10mg/mL TTC 标准品。2-8℃可以保存 1 周，若出现红色，则不能使用。

自备实验用品：

      可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板(非聚苯 乙烯材质)、研钵/匀浆器、乙酸乙酯（>98%，AR），冰和蒸馏水。

样品的制备：

样本的制备：将根部组织洗净，去除根上的泥土，轻轻擦干，不要过分挤压破坏根系细胞。

测定步骤：

1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 485nm，可见分光光度计用乙酸乙酯调零。

2、 标准品的稀释： （1） 临用前取 10μL 10mg/mL TTC 标准品，加入 1990μL 试剂二，充分混匀，配制成 50μg/mL TTC 标准品， 现用现配。（后续实验需要 1000μL，为减小实验误差，故配制大体积。） （2） 取 1mL 50 μg/mL TTC 标准品加入到一支试剂三内，充分震荡混匀 2min。混匀后加入 1mL 乙酸乙酯， 再次充分震荡混匀 2min，室温静置分层 5min，取上层溶液（此上层溶液即为 50 μg/mL TTC-乙酸乙酯 标准品）。 （3） 将上层溶液用乙酸乙酯进行稀释，得到 20μg/mL 标准品备用（吸取 200μL 50 μg/mL TTC-乙酸乙酯标 准品加入 300μL 乙酸乙酯混匀即可）。

3、标准品的测定 取 200μL 20μg/mL 标准品和 200μL 乙酸乙酯（即 0μg/mL）于微量玻璃比色皿或 96 孔板(非聚苯乙烯材质)中， 分别测定其在 485nm 处的吸光度。计算 ΔA 标准= A（20μg/mL）-A（0μg/mL）。ΔA 标准只需做 1-2 次。

4、在 2mL EP 管按下表步骤加样：

     充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，12000 rpm，4℃，离心 10min，取 200μL 上清至微量玻璃比色皿或 96 孔板(非聚苯乙烯材质)中，测定 485nm 下的吸光值。计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照（标准曲线 只需做 1-2 次，每一个测定管对应一个对照管）。ΔA 测定的测定范围在 0.005-1.5 之间。

 根系活力计算：

按照样本质量计算根系活力：以 TTC 的还原量来表示根系活力

TTC 还原强度 [ μg TTC/(g·h) ] =ΔA 测定×C 标÷ΔA 标准×V÷ (W×T)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

W：根重，g；C 标：标准品浓度，20μg/mL；T：反应时间，4h；V：试剂四的体积即匀浆体积，1mL。

注意事项：

1、 试剂四容易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。

2、 若样品 37℃暗反应未到 4h 但根系已出现深粉色，此时可以直接进行下一步实验操作；若 ΔA 测定大于 1.5， 可以减少样本质量或者缩短反应时间进行实验，计算公式注意修改。

3、 若 4h 暗反应结束后，根系没有出现粉色或者 ΔA 测定小于 0.005，可以延长暗反应时间（8h，16h 甚至 24h） 或者加大样品量，计算公式注意修改。

4、 如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如 15000rpm 4℃离心 20min。

产品仅用于科研等非医疗用途！