• 说明书丨HRF0703-miRNA逆转录试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      miRNA第一链cDNA合成试剂盒是采用茎环法原理的专用试剂盒， 5×Reaction Mix为一管式反转录预混液，含有反转录所需的所有试剂（反转录酶、RNase Inhibitor、dNTPs、Buffer），只需加入模板RNA和茎环引物即可进行反应，使得cDNA的合成更加的方便快捷。

      本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊gDNA Remover，不需要中途开盖添加，只需一步操作，即可同时完成基因组清除与逆转录反应，大大的简化了操作步骤，避免了繁杂的加样过程对样品造成的污染和RNA的降解。本试剂盒的反转录酶具有极高的热稳定性，经过特别优化的缓冲体系，最大限度保证各种miRNA特异性逆转录产物的合成。同时产物cDNA的兼容性好，可以适配市面上主流的荧光定量mix做下游检测试验。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

注意事项

1）尽量避免RNase对样品的污染；

2）为保证逆转录的成功，请尽量获得高质量的RNA样品；

3）5×Reaction mix和gDNA Remover含有甘油，比较粘稠，溶液易挂壁和吸附在移液枪头外导致产品损耗，因此，在使用前请点甩离心后使用，同时使用低吸附移液枪头；

4）5×Reaction mix和gDNA Remover所包含的酶均足够量。即使每次5×Reaction mix只用3.6μl或0.8μL的gDNA Remover都不会对使用效果造成影响。

5）本产品仅作科研用途！

使用方法

一、茎环法miRNA第一链cDNA合成(以20 μl反应体系为例，可使用10μL体系)

1.使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。

2.在无RNase管里面加入以下成分：(建议使用PCR管冰上配制，置PCR仪反应)

* 在反应中使用的total miRNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA， 单miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。

3.移液器轻轻吹打混匀，按下列条件进行第一链cDNA合成反应：

*  如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至55°C有助于提高产量。得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应，或在-20°C保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70°C保存。cDNA应避免反复冻融。

二、RT-qPCR

      取适量反转录cDNA产物（一般不超过qPCR反应体积的1/10）作为qPCR模板，按照厂家荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。 如果表达基因含量丰富，可以根据实际适当稀释cDNA模板使用。

如果茎环引物按照我司推荐设计，则配套通用下游引物序列：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT- 3'

三、引物设计：

1.推荐通用茎环结构序列5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC- 3'

2.茎环尾加碱基（和miRNA3’互补碱基）长度一般为5-8个碱基，本公司建议新手起始首选尾加互补碱基为6个碱基。逆转录引物只需根据miRNA序列在茎环序列上添加6个碱基即可。

3.配套通用下游引物序列：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT- 3'

茎环引物设计软件可以采用任意商业化公司的设计软件，也可以联系本公司索取引物设计软件。