• 说明书丨HRN0147-Tripure LS Reagent 总RNA提取试剂（同TRIzol LS®）.pdf

产品信息

产品描述

     TRIPure LS Reagent 是直接从人，动植物，酵母，细菌，血液和病毒的液体样品中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

      无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g) 和细胞(>10⁷)均有较好的分离效果。TRIpure LS试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIpure 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆等。如果是用于 PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用扩增级的 DNase I 来处理抽提的总RNA。

产品组分

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

应用范围

适用于各种来源于人，动植物，酵母，细菌，血液和病毒的液体样品中总 RNA、DNA、蛋白的快速抽提。

预期产量

表 1. 每毫升液体样品或组织的预期RNA产量

【注】：过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。

操作流程

1. 匀浆化作用

（1）生物液体

每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml TRIpure LS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75mlTRIpure LS。TRIpure LS 和液体样品的终体积比总是3：1。

（2）组织

用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加0.75ml的TRIpure LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml，如果组织样品的体积小于0.25ml，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3：1。

（3）单层生长的细胞

直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRIpure LS溶解细胞，用加样枪吹打帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIpure LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养液已经充分稀释了TRIpure LS。

（4）悬浮生长的细胞

通过离心来沉淀细胞。在TRIpure LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×10⁶的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×10⁷细菌加0.75ml的TRIpure LS。和步骤2）一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升。在加入TRIpure LS前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

可选方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤

2. 分离阶段

将匀浆样品在 15-30°C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。每 0.75mL TRIpure LS加 0.2mL 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒并将其在室温下孵育 2~15分钟。在 2~8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟。离心后混合物分成三层：下层苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加 TRIpure LS容量的70%。

3. RNA的沉淀

将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离 DNA 和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA。最初均化时的每 0.75mL TRIpure LS 对应 0.5mL 异丙醇。将混合的样品在 15 -30°C 条件下孵育 10 分钟并在 2~8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。RNA 沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4. RNA的漂洗

移去上层悬液。用 75%的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，每 0.75mL 的 TRIpure LS至少加 1mL 的 75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在 2~8°C 下以不超过 7,500×g 的离心力高速冷冻离心 5 分钟。

5. RNA 的再溶解

在操作的最后，简单干燥 RNA 沉淀（空气干燥或真空干燥 5~10 分钟）不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是，不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 A260/280 比值<1.6。用移液管尖分几次移取无 RNA 酶的水或 0.5%SDS 溶液来溶解 RNA（当 RNA 以后要用于酶切反应时，避免使用 SDS。）RNA 还能被 100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在-70°C。

6. 产物检测

A、RNA完整性检测

1）取 1 µLRNA 加入适当 RNA loading buffer，混匀。

2）进行电泳检测。若出现清晰的三条带，证明 RNA完整性较好。

B、RNA 纯度检测检测

260 nm，280 nm OD 值，并计算 A260/A280 比值。纯的 RNA 的比值应在 2.0 左右。

运输和保存方法

冰袋运输。2-8℃，避光保存，有效期1年。

注意事项

1.本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。有毒物接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤。一旦接触 皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案。

2.请穿实验服并佩戴一次性手套操作，当 TRIpure LS用量少于 2mL 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管，避免 RNase 污染。

3.当 TRIpure LS用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入 TRIpure LS和氯仿后 12,000×g 的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。

4.需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取 RNA专用）、75%乙醇 (DEPC 处理水配制)、DEPC 和 DEPC 处理水。

5.样品用TRIPure LS Reagent 匀浆后和加入氯仿之前，样品可以在–60~–70°C 保存至少一个月。RNA 沉淀（步骤 4，RNA 漂洗）溶于 75%的乙醇在 2~8°C 至少可以保存一周，在–5~–20°C 下至少可保存一年。

6.RNA沉淀在 75%乙醇中，4℃可保存 1 周，-20℃可保存 1 年。

7.从少量的组织(1~10mg)或细胞(10²~10⁴)中分离 RNA 样品：调整样品体积到0.25ml，往组织或细胞中加入 0.75ml TRIpure LS。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉淀 RNA 之前，加入 5~10μg 无 RNA 酶的glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制 PCR。

8.在匀浆化后和加入氯仿之前，样品可以在–60~–70°C 保存至少一个月。RNA 沉淀（步骤 4，RNA 漂洗）放置于 75%的乙醇在 2~8°C 至少可以保存一周，在–5~–20°C下至少可保存一年。

9.RNA半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。

10.本产品仅作科研用途！

常见问题及解答

问题1.抽提得率低

答：

1、样品均化或者裂解不完全。

2、终RNA不完全溶解

问题2.A260/A280比率<1.65

答：

1、在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。

2、样品匀浆化时所加的TRIpure LS量太少。

3、匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。

4、分离的水样层中污染有苯酚层。

5、终RNA没有完全溶解。

问题3.RNA 降解

答：

1、从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。

2、用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于–5~–20°C，而不是存放于–60~–70°C。

3、细胞经胰酶消化而分散。

4、水溶液或试管污染有RNA酶。

5、用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。

问题4.DNA污染

答：

1、样品匀浆化时所加的TRIpure LS 量太少。

2、用于抽提的样品包含有机溶媒（例如，乙醇，DMSO），强缓冲液，或碱性溶液。