HRbio™ 荧光定量PCR试剂盒

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产品信息

产品名称	产品编号	规格
HRbio™ 荧光定量PCR试剂盒	HRF0067	5X1 mL

产品描述

本产品是采用 SYBR GreenI嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂,将热启动TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBR GreenI等试剂预混成即用的2x Mix，可对目标cDNA进行快速并具有高特异性的定量检测。本产品采用化学修饰的Hot Start Taq DNA聚合酶，在50°C以下无活性，只有 95°C条件下加热后才能完全恢复酶的活力，最大限度减少非特异性扩增产物的产生，提高荧光定量PCR反应的精确性。该试剂盒独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。

产品组分

产品编号	产品名称	规格
1	2×SYBR Green qPCR Mix	5X1 mL
2	50×ROX Reference Dye	1 mL

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光保存，有效期12个月。

本品避免反复冻融。将冻存的 SYBR Green qPCR Mix 和 ROX Reference Dye 融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。

配制 Real-Time PCR 反应体系

将所有试剂 2×SYBR Green qPCR Mix，ROX Reference Dye，模板，引物和 RNase-FreeddH2O，在室温下融解并彻底混匀，避免产生气泡。短暂离心后，置于冰上按照下表配制反应液。

参考下表配制反应体系：

组分	20 μL 体系	50 μL 体系	终浓度
2×SYBR Green qPCR Mix	10 μL	25 μL	1×
Primer F (10 μM)*	0.4~0.8 μL	1.5 μL	0.2~0.4 μM*
Primer R (10 μM)*	0.4~0.8 μL	1.5 μL	0.2~0.4 μM*
50 × ROX Reference Dye**	－	－	－
cDNA 模板	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至 20 μL	至 50 μL	－

一般来说反应体系中引物终浓度为2 uM 即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度 0.2~0.4 uM 范围内调整引物浓度。

2）几种常见仪器的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表：

仪器型号	使用浓度
ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT/StepOne/ StepOne Plus 等	20 μL 体系加 4 μL， 50 μL 体系加 10 μL
ABI 7500/7500 Fast、QuantStudio ® 3/5、QuantStudio 6/7 Flex、ViiA 7、 Stratagene Mx3000P/Mx3005P和Mx4000等	20 μL 体系加 0.4 μL， 50 μL 体系加 1 μL
Roche、Bio-Rad、Eppendorf 等	无需添加

2、盖上或密封反应管/PCR 板，轻轻混匀。短暂离心，确保所有组分都在管/板底。

进行 Real-Time PCR 反应

建议采用两步法 PCR 反应程序进行反应。

两步法反应程序:

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	10 sec	40
退火/延伸	60℃	30 sec★	40
熔解曲线阶段	根据仪器推荐程序设置

若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行 PCR 反应。

三步法反应程序:

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	10 sec	40
退火	50-60℃	30 sec
延伸	72℃	30 sec★
熔解曲线阶段	根据仪器推荐程序设置

注意事项

1）使用时请上下颠倒轻轻混匀，不要使用振荡器，尽量避免出现泡沫，短暂离心后使用。

2）引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用 PAGE 级别以上纯化的引物。

3）20 μL 反应体系中，cDNA 模板的使用量一般小于 100 ng，基因组 DNA 模板量一般小于50 ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过 PCR 体系终体积的 10%。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！