产品信息

产品描述

      本试剂盒可快速从各种细菌中提取基因组DNA。细菌样品加入细胞核裂解液，在强裂解液作用下，细菌释放出基因组DNA，接着加入RNase A去除RNA，然后在蛋白沉淀液作用下选择性沉淀去除蛋白，最终基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

      本产品提取出的DNA可直接用于构建文库，PCR，Southern-blot 和各种酶切反应。

试剂盒组分

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

2）溶液可能出现析出和沉淀，可以在65℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

3）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

使用方法

1、收集10 毫升过夜培养细菌加入 15 毫升离心管。

2、2,000xg 离心 3 分钟，使细胞沉淀下来，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。对革兰氏阳性菌，接步骤 3。对革兰氏阴性菌，直接接步骤 6。

3、加入4.8ml 50mM EDTA (PH 8.0) 完全重悬细胞。

4、加入1.2ml 溶菌酶(20mg/ml)，混匀。

对于大部分的革兰氏阳性菌如 Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous，和 Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的 Staphylococcus，则应该加入 60μL 溶菌酶(20mg/ml) 和 60μL lysostaphin (20mg/ml) 确保有效裂解。

5、37℃温育 30-60 分钟。2,000xg 离心 10 分钟，弃上清, 吹打涡旋打散细胞沉淀。

6、加入9ml 细胞裂解液至打散的细胞，轻柔吹打裂解细胞。

7、80℃温育 5 分钟裂解细胞，然后冷却至室温。

8、加入18μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中至终浓度 20μg/ml。颠倒混匀后 37℃温育15-60 分钟去除残留 RNA。然后室温冷却至少 5 分钟使回复到室温。

9、在回复到室温的裂解物内加入 3ml 蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25 秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴 5 分钟。由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA。如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组 DNA；但是力度也不能小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则 DNA 无法和蛋白质沉淀分离开，离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成 DNA 丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的产物污染有较大量的蛋白质。因此建议用涡旋振荡器。

10. 5,000xg(可根据需要调整加大离心力)离心 10 分钟。这时应该可以见到管底蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。

11、小心吸取上清到一个新的 50ml 离心管中。吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心 5 分钟后取上清。

12、加入等体积的室温异丙醇（（约 9ml），轻柔颠倒 30 次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白色 DNA 沉淀。注意有时候棉絮状（丝状）DNA 颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口处，即使颠倒也不跟下来，这样导致操作者看不到沉淀，误认为没有得到DNA。解决办法是略去步骤 13，直接 2,000xg 2,000xg 2,000xg 2,000xg 离心 5 分钟，弃上清，然后接步骤 15。

13、垂直放置离心管，让白色 DNA 沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。

14、加入9ml 70％乙醇后，颠倒几次漂洗 DNA 沉淀，2,000xg 离心 3-5 分钟，在管底可以见到白色的 DNA 沉淀块，倒弃上清。

15、加入5ml 70％乙醇，颠倒几次漂洗 DNA 沉淀，2,000xg 离心 1 分钟， 倒去上清（注意不要把 DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。注意不要干燥过头，否则 DNA 极其难溶；也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。

16、加入500μl DNA 溶解液重新水化溶解 DNA 沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在 65℃温育30-60 分钟（不要超过一小时），中间不时的轻弹管壁帮助重新水化 DNA。也可以在室温或者 4℃放置过夜来重新水化 DNA，中间不时颠倒轻弹帮助溶解。

17、DNA 可以存放在 2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃